کلونینگ و بیان اریتروپوئتین نوترکیب انسانی در اشرشیاکلی

اریتروپوئیتین نوترکیب انسانی (rhepo) بطور وسیع در درمان کم خونی استفاده می شود. اما به دلیل نیمه عمر کم، مصرف آن به عنوان دارو محدود شده است زیرا برای رسیدن به اثرات درمانی باید هفته ای 3-2 بار آن را تزریق نمود. مطالعات زیادی به منظور افزایش نیمه عمرin vivo اریتروپوئیتین صورت گرفته که از آنها می توان به مهندسی قند، اتصال به قسمت ثابت ایمنوگلبولین ها و اتصال به پلیمر پلی اتیلن گلیکول اشاره نمود. "سیستئین پگیلاسیون" یک روش پگیلاسیون اختصاصی می باشد که در آن پلیمر پلی اتیلن گلیکول از طریق یک اسیدآمین? سیستئین آزاد به پروتئین متصل شده و منجر به افزایش نیمه عمر به خاطر کاهش کلیرانس کلیوی و اثر محافظتی پلیمر در برابر آنزیم های تخریب کننده می شود. همچنین بخاطر افزایش زمان باقیماندن پروتئین پگیله در جریان خون، فعالیت زیستی in vivo آن تا چندین برابر افزایش می یابد. در این روش جهت اتصال پلیمر پلی اتیلن گلیکول به پروتئین نیاز به اسیدآمینه سیستئین آزاد در پروتئین می باشد. در نتیجه تولید و بیان آنالوگ های سیستئینی اریتروپوئتین و ارزیابی فعالیت بیولوژیکی آنها امری اجتناب پذیر می باشد. در این تحقیق بیان آنالوگ سیستئینی اریتروپوئتین در باکتری اشرشیاکلی مورد بررسی قرار گرفته است.در مطالعات قبلی مکان های مورد نظر در پروتئین برای جایگزینی با اسیدآمینه سیستئین، به روش in silicoتعیین و سپس آنالوگ سیستئینی 31 به روش overlap pcrاز روی cdna اریتروپوئیتین ساخته شد. آنالوگ سیستئینی ساخته شده، در وکتور بیانی pet-26b کلون شد و این سازه ها به روش کلرید کلسیم و شوک حرارتی به درون سلول هایe.coli bl21de3 وارد شدند. بیان پروتئینهای نوترکیب توسط iptgالقا شد. تاییدبیان با استفاده ازروشهایsds page و western blot (با استفاده از آنتی بادی ضد his-tag) انجام شد. خالص سازی به روشaffinity choromatography ( با استفاده از نیکل و ( his-tag انجام شد.در آخر تعیین فعالیت بیولوژیکی به روش برون تنی (mtt assay) صورت گرفت و نشان داد که آنالوگ سیستئینی شماره 31 دارای فعالیت زیستی مشابه با اریتروپوئتین طبیعی بوده و می تواند برای پگیلاسیون مورد استفاده قرار بگیرد.